实际上，从色谱柱到色谱柱的重现性应该比较好的。即使是批次间的重现性也应比您观察到的要好。如果您从信誉良好的生产商处购买色谱柱，则批次间的重现性应优于±10%，甚至优于±5%。您是否调查过两个色谱柱是否均使用同一批填料制备?

问：我有两个来自同一制造商的相同类型的反相C18色谱柱，它们的保留时间差异很大(40%)。问题是什么?

　　答：这显然是一个严重的问题。相同填料的色谱柱之间的保留时间重现性应比较好，一搬在±5%的范围内。对于更高质量的填料，保留时间的重现性约为±2%，但是要达到这个重现性水平，还需要良好的温度控制。知道了这一点，您的这个色谱柱的重现性结果显然是不可接受的。让我们调查一下可能出现的问题。首先，让我问一个问题：是否其中一根色谱柱使用次数较多?发现新旧色谱柱之间保留时间的差异并不少见。如果使用的旧色谱柱接近键合相pH值稳定性的极限，则尤其要注意。同样，如果样品中的某些成分长时间累积在色谱柱上，则观察到保留时间出现变化也很常见。样品保留成分的积累会导致保留率的急剧变化。在这种情况下，有必要选择一下合适的清洗方案，从色谱柱中除去该样品保留成分。那么，这两根色谱柱中的哪一根使用的多?

　　问：都不是!两根色谱柱都是新的，刚从色谱柱盒中取出来使用的。我希望从全新的色谱柱上获得更好的重现性。

　　答：实际上，从色谱柱到色谱柱的重现性应该比较好的。即使是批次间的重现性也应比您观察到的要好。如果您从信誉良好的生产商处购买色谱柱，则批次间的重现性应优于±10%，甚至优于±5%。您是否调查过两个色谱柱是否均使用同一批填料制备?

　　问：是的，我调查过，生产商确定这两根色谱柱是同一批填料生产的。

　　答：这使得保留时间差异变得更难以理解。目前看来两柱子之间的唯一区别是填充过程。色谱柱的填充过程具有足够的可重复性，填充密度的变化不会超过±2%，因此，保留时间的变化不应超过±2%。即使将流动相组成的不确定性加上包装过程的不确定性考虑进去，仍无法解释您所观察到的较大的保留时间差异。

　　通常，流动相配比时的错误可能是对您的观察结果的解释。如果流动相的有机相含量变化1%，则保留时间差异可能为10%。另一方面，在许多情况下，高达20%的流动相缓冲液浓度差异会导致保留时间差异仅为1%。另一种可能是流动相pH值有些误差。如果待测物的pKa接近流动相缓冲液的pH值，则pH值变化0.1个单位会导致保留时间差异为10%。因此，必须仔细检查流动相的pH值。

　　其他外部影响不太明显。柱温变化每5ºC会影响约10%的保留时间的变化。因此，柱温变化不太可能是造成这个问题的原因。如果流动相中含有离子对，通常会在色谱柱尚未完全与流动相平衡时使用。用离子对试剂时，平衡色谱柱通常需要几百毫升的流动相，特别是当流动相中离子对试剂的浓度较低时。

　　其他的外部影响则不那么明显，温度变化每5ºC影响近似10%，因此，温度的变化不太可能是导致你的问题的原因，如果您正在处理离子对分离，在不知不觉中使用尚未与移动阶段完全平衡的色谱柱并不罕见。通常需要100mL移动用离子配对试剂平衡该柱，特别是在离子配对试剂的移动相浓度较低的情况下。

　　问：我没有使用离子对试剂。另外，补充说明，两个色谱柱均使用相同的流动相进行了验证，(这种差异)结果是可重复的。这不包括您刚才描述的影响，不是吗?

　　答：这使得解释变得更加困难，在开始测试之前如何处理色谱柱?

　　问：两者的处理方式完全相同。我把它们从盒子里拿出来，用流动相平衡了它们。

　　答：嗯...现在变得越来越困难。总而言之，我们有两个新色谱柱，它们是用同一批次的填充材料制备的，却得到截然不同的色谱结果。唯一合理的解释是，色谱柱平衡存在一些差异，导致保留时间发生这些变化流动相中有机溶剂的浓度是多少?

　　问：流动相几乎是100%的水溶液。它由98%的缓冲液和2%的甲醇组成。我从包装盒中取出色谱柱，并在开始注入样品前用流动相平衡了一个小时。

　　答：现在我们越来越近了。流动相中有机溶剂的浓度低，保留时间差异是由于色谱柱的润湿性差异引起的。疏水性强，封端良好的C18色谱柱的保留时间可能会有所不同，这取决于它们所经历过的事情。如果两根色谱柱之一在运输过程中意外干燥或部分干燥，则其保留时间会比完全浸润的C18色谱柱小很多。这是因为，水和含水量很高的流动相不能很好地浸湿疏水性C18的表面。因此，当使用含水量高的流动相时，只有C18填料的一部分可用于保留。因此，保留因子显著低于在浸润良好的色谱柱上的保留因子。您可以通过先用100%甲醇重新浸润色谱柱，然后再用流动相重新平衡来解决该问题。该“再润湿”步骤可确保填料的整个表面都与待测物发生相互作用。对两个色谱柱都执行完此操作后，保留时间即可重现，也许会接近1%。根据问题的描述以及我们已经消除了所有其他可能性的事实，我非常确定这是造成保留时间问题的原因